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產品分類
 
·PCR
 
 
 





基因定點突變試劑盒
 產品貨號: RF301
 產品名稱: 基因定點突變試劑盒
 產品價格/規格: 5次/20次 0元/1000元
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 更新時間: 2019-07-23
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                         基因定點突變試劑盒
    一、產品簡介:

    本產品采用高保真的pfu酶,通過反向PCR法(Inverse PCR)進行定點突變。以環狀DNA(如質粒)為模板,以反方向設計的兩條引物對質粒進行完整的PCR,pfu DNA聚合酶合成突變鏈;隨后使用GM酶消化PCR產物,降解非突變型質粒模板(甲基化質粒模板),隨后進行轉化感受態細胞,有效地篩選出突變克?。ㄍ家唬?。


    本產品特征:

    1. 采用部分重疊引物設計(圖二),使PCR呈指數擴增,擴增產物凝膠電泳可見;擴增產物為環狀,易于轉化。

    2. 突變的真實性:可以得到高達95%的突變體。而且,由于采用pfu 高保真聚合酶,PCR過程中的第二位點突變(目標突變以外的突變)的可能性極小。

    二、保存條件:

    -20保存,有效期一年

    三、產品組成:

     

    內容

    RTF3101-015次)

    RTF3101-0220次)

    pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μl

    20 U

    100 U

    2×pfu PCR buffer(含Mg2+

    0.1 ml

    0.5 ml

    10mM dNTP

    15 μl

    50 μl

    GM酶(5 U/μl

    6 μl

    22 μl

    pTGWB(Control plasmid,10ng/μl)

    5 μl

    25 μl

    Control Primer(RV+FW,5 μM each)

    5 μl

    25 μl

    DH5α化學感受態細胞(100μl/支)

    5

    20

    Water(RNase-free,DNase-free)

    1ml

    1ml


    四、使用說明

    1. 引物設計(圖二)

    (1) 共需設計兩條部分序列重疊的引物。引物包含5' 端重疊區和3' 端延伸區。

    (2) 引物長度:兩條引物的長度大約30-45個核苷酸,5' 端重疊區包含15-20個堿基,3' 端延伸區包含至少10個堿基。

    (3) 突變引物:突變點位于兩條引物上;正向引物的突變點位于重疊區下游,緊鄰重疊區;反向引物的突變點位于5' 端。

    (4) 引物GC含量:在可能的情況下,盡量把引物的GC含量控制在40-60%。

    (5) 在可能的情況下,盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可以通過一些軟件進行分析,如Oligo。

    (6) 最好使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。

    2. 待突變模板質粒的選擇:

    必需使用從dam的大腸桿菌(這類菌中質??梢員患諄?/span>)中抽提得到的質粒用于基因定點突變,如DH5α、JM109等。

    選擇GC含量在40-55%的待突變模板質粒,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果GC含量過高,請先把目的基因克隆到其它合適的載體上,再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范圍,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果目的基因GC含量過高,而突變位點不在高GC含量區域,可以先把該基因的不含高GC含量的一個區域克隆出來,進行定點突變,然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質粒模板,或者有局部高GC含量的質粒模板,請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。

    3. 對照質粒:

    本試劑盒中含有對照質粒(pTGWB),其LacZ基因已經突變,第6個氨基酸密碼子突變為TAA(終止密碼子)(圖三)。當被轉化入大腸桿菌后,在X-Gal板上形成白色菌落。利用試劑盒添附的對照引物進行突變反應后,該密碼子可從TAA(終止密碼子)恢復為CCAPro),轉化后可在X-Gal板上產生藍色菌落,這樣就可以簡單地確認突變反應是否正確進行。根據本實驗操作步驟進行該突變反應,通??苫竦?/span>80%以上的藍色菌落。



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