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產品分類
 
·PCR
 
 
 





DNA非變性PAGE電泳試劑盒
 產品貨號: RTE4101
 產品名稱: DNA非變性PAGE電泳試劑盒
 產品價格/規格: 100次 450元
 產品說明書: 點擊查看
 更新時間: 2019-10-18
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  •   DNA非變性PAGE電泳試劑盒(貨號RTE4101   Ver.690775

    DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

    產品組成:

    貨號

    名稱

    規格

    保存條件

    AC2913-02

    30%PAA(29:1)

    500 ml

    4

    TB001

    5×TBE

    500 ml

    RT

    AP020P

    APS(干粉)

    0.5 g

    RT配制后-20貯存

    TA0761-01

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    DL070

    6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液

    1 ml

    4

    產品簡介:

    非變性 PAGE 電泳是研究DNA構象變化的常用手段,在非變性條件下DNA的泳動與電荷、片段大小、DNA結合的蛋白及折疊構象都有關系。非變性PAGE電泳是研究單鏈 PCR片段構象多態性(SSCP-PCR,single-strand conformation  polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP測定中,雙鏈DNA(dsDNA)變性為單鏈DNA(ssDNA),每一條單鏈DNA都基于他們的內部序列呈現不同的折疊構象,即使相同長度的單鏈DNA因其堿基順序不同,甚至單個堿基的不同都會形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得到分離。

    本公司提供的DNA非變性PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑,用戶只需自備制膠器具和蒸餾水,即可配制各種濃度的PAGE膠,使用方便。

    按照每次制備100 ml 12%凝膠計算,試劑盒可配制10-12塊非變性PAGE膠;按照每次制備8 ml 12%凝膠計算,試劑盒可配制至少100塊非變性PAGE膠。

    貯存和效期:

       本產品常溫運輸,按照標簽溫度貯存;有效期一年。

    使用說明:

    一、制備凝膠步驟:

    10% APS配制-5 ml

    將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中,徹底溶解后分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為一周,-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長,應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

    1.參照凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

    2.根據表一和表二,將不同體積的成分在適當容器中混合。

    表一 配制不同濃度凝膠所需各組分的體積(總體積100 ml,適用于大板膠)

    各組份體積(ml

    最佳DNA分離范圍

    凝膠濃度

    滅菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    總體積

    80-500 bp

    5%

    63.3

    16.7

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    70-450 bp

    6%

    60

    20

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    60-460 bp

    8%

    53.3

    26.7

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    50-300 bp

    10%

    46.7

    33.3

    20

    0.5-0.8

    0.1

    100 ml

    40-200 bp

    12%

    40

    40

    20

    0.5-0.8

    0.1

    100 ml

    25-150 bp

    15%

    30

    50

    20

    0.5

    0.1

    100 ml

    5-100 bp

    20%

    13.3

    66.7

    20

    0.5

    0.1

    100 ml

    表二 配制不同濃度凝膠所需各組分的體積(總體積8 ml,適用于小板膠)

    各組份體積(ml

    最佳DNA分離范圍

    凝膠濃度

    滅菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    總體積

    80-500 bp

    5%

    5.07

    1.33

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    70-450 bp

    6%

    4.8

    1.6

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    60-460 bp

    8%

    4.27

    2.13

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    50-300 bp

    10%

    3.73

    2.67

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    40-200 bp

    12%

    3.2

    3.2

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    25-150 bp

    15%

    2.4

    4

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    5-100 bp

    20%

    1.07

    5.33

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    注: = 1 \* GB3 有大量文獻報道PAGE膠中加入5%-10%的甘油能提高某些位點的分辨率。如果選擇加入10%的甘油,則相應減少去離子水的用量。

    = 2 \* GB3 凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿莼肪澄露鵲牟煌鶻贏PS的加入量。

    3.在凝膠模具中灌入適量凝膠溶液,在膠的液面距離達到頂部時停止灌膠,插入梳子。

    4.常溫靜置30-60分鐘,

    注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿莼肪澄露鵲牟煌鶻贏PS的加入量。

    5. 拔出梳子,用1×TBE液沖洗加樣孔。

    6.4冰箱預冷30分鐘或過夜預冷。為了防止膠收縮,最好頂部加少量1×TBE緩沖液。預冷的膠有利于保持單鏈DNA的構型。

    二、電泳:

    7.  將預冷的凝膠板固定在電泳裝置上,往上槽和下槽中加入足夠1×TBE電泳液。

    8.  取 5-10 μl SSCP-PCR樣品,加入相應體積6×Native PAGE DNA上樣液,85℃5分鐘后冰浴,短暫離心后取2-5 μl上樣。

    9.  連接電源線,打開電源開關。按照5V/cm 電壓電泳。由于溫度變化過大會改變 DNA 構型,所以電泳時最好能保持恒溫。對不含甘油的PAGE,最好恒溫在4℃,對含甘油的PAGE,最好恒溫在25℃。

    10.  終止電泳,取出凝膠進行后續的處理(如銀染)(核酸快速銀染試劑盒 Cat RTS5101) 。

    常見問題:

    1. 為何 SSCP-PCR帶型有復合條帶?

    原因之一:可能是殘留的 PCR 引物跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電泳前將PCR產物進行純化。

    原因之二:可能是PCR產物用量過高,彼此復性。解決辦法是將PCR產物稀釋后4-8倍后使用。 

    2. 如何提高電泳分辨率?

    可以在配膠時加入甘油(終濃度為5%-10%),因為甘油是弱變性劑,能部分展開 DNA 折疊結構,增加表面積,增加電泳時位移差異。但加入甘油后粘性變大,電泳速度變慢,因此只適合常溫電泳使用,不要4℃電泳。如果條件允許,最好同時做加甘油和不加甘油的電泳實驗。



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