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·PCR
 
 
 





pfu DNA聚合酶
 產品貨號: RTH3102
 產品名稱: pfu DNA聚合酶
 產品價格/規格: 100U/5×100U
 產品說明書: 點擊查看
 更新時間: 2019-07-23
詳細信息   訪問次數:次

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  • pfu DNA Polymerase

    高保真平末端DNA聚合酶

    目錄號

    濃度

    包裝

    價格

    RTH3102-02

    2.5 U/μl

    100 U 40μl

    100

    RTH3102-03

    2.5 U/μl

    5×100 U5×40μl

    450

    貯存

       -20保存一年。

    產品簡介

    pfu DNA Polymerase是嗜熱古細菌來源的DNA聚合酶,該酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外,還具有很強的3’-5’外切酶活性,增強了PCR擴增的保真度。與Taq酶相比,pfu聚合酶熱穩定性更好,更能忍耐較高的變性溫度。Pfu的保真性是Taq DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度為0.5kb/分鐘。PCR產物3’端不帶堿基A,為平滑末端,要通過平滑末端克隆法進行克隆。

    產品組成(RTH3102-02

    pfu DNA Polymerase2.5U/μl            40μl

    10×pfu PCR buffer(含Mg2             1ml

    活性定義

    1單位(U) pfu DNA Polymerase活力定義為在74、30分鐘內,以活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質所需的酶量。

    酶貯存緩沖液

    50 mM Tris-HCl (pH 8.0); 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50 mM KCl ; Stabilizers; 50% glycerol

    適用范圍

    高保真的DNA片段的擴增、DNA片段的平滑化。

    使用說明:

    1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應體系:

    成分

    20μl反應體系

    50μl反應體系

    終濃度

    Template

    0.04-0.2 μg

    0.1-0.5 μg

    as you wish

    Primer 110 μM

    0.4 μl

    1 μl

    0.2 μM

    Primer 210μM

    0.4 μl

    1 μl

    0.2 μM

    10×pfu PCR buffer(Mg2+)

    2 μl

    5 μl

    dNTP Mixture(10 mM)

    0.4 μl

    1 μl

    200 μM each

    pfu (2.5 U/μl)

    0.4 μl

    1 μl

    0.05U/μl

    ddH2O

    up to 20 μl

    up to 50 μl

    -

    1:如果需要改變Mg2+濃度,根據下表調節

    PCR反應體系中Mg2+終濃度

    2 mM

    2.5 mM

    3 mM

    4 mM

    20μl反應體系中25 mM MgSO4加入量

    0 μl

    0.4 μl

    0.8 μl

    1.6 μl

    50μl反應體系中25 mM MgSO4加入量

    0 μl

    1 μl

    2 μl

    4 μl

    2:配制反應液時,請最后加入pfu,因為本酶有很強的3’-5’外切酶活性,有可能降解引物。

     

    2. 混勻后,離心快甩將反應液收集到管底。

    3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話,補加25μl礦物油。

    4. PCR儀上執行以下程序:

    步驟

    溫度

    時間

    循環數

    初始變性

    94

    3-5 min

    1

    變性

    94

    30 sec

    25-40*

    退火

    50-60*

    30 sec

    延伸

    72

    0.5kb/min*

    最后延伸

    72

    5 min

    1

     

    *注: PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況,設定最佳的反應條件(溫度、時間等)。

    ● 注意事項

    1. pfu 酶具有 3-5的外切酶活性,所以 pfu 酶擴增時延伸速度遠比 Taq 酶低,應根據擴增產物的長度設置相應的延伸時間,一般情況下 pfu 酶的延伸速度為每分鐘 0.5kb;同時 pfu 酶的 3-5的外切酶活性可能降解引物,所以應最后把pfu 酶到反應體系中,并立即進行 PCR 反應。

    2. pfu 酶的熱穩定性比 Taq 酶好,對于 GC 含量很高的模板,變性溫度可以提高到98,對 pfu 酶的活性無影響。

    使用舉例:

    水稻基因組做模板



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