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產品分類
 
·PCR
 
 
 





2×SYBR qPCR MasterMix
 產品貨號: RTQ3101
 產品名稱: 2×SYBR qPCR MasterMix
 產品價格/規格: 1ml 300元/5×1ml 1200元/25×1ml 5000元
 產品說明書: 點擊查看
 更新時間: 2019-10-18
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    2×SYBR qPCR MasterMix         

    產品包裝:

     

     

    組成

    RTQ3101-02

    (可做4050 μl反應)

    RTQ3101-03

    (可做20050 μl反應)

    RTQ3101-04

    (可做100050 μl反應)

    長期貯存

    2×SYBR qPCR MasterMix

    1ml

    5×1ml

    25×1ml

    -20℃

    ROX Solution I (50×)

    40μl

    200μl

    5×200μl

    -20℃

    ROX Solution II (50×)

    40μl

    200μl

    5×200μl

    -20℃

     

    注:以50μl qPCR反應體系為例,每次使用25μl 2×MasterMix,1ml可做40 50μl qPCR反應。

    儲存條件: -20℃避光保存;經常使用時,一旦融化后請4℃貯存,4℃保存至少3個月;盡量避免反復凍融。

    產品簡介:

    本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑。已經將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一種適合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑,具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點。

    本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶,并結合精心優化的反應 Buffer,從而有效抑制低溫下的非特異性擴增,提高反應特異性和擴增效率,能夠在更寬廣的范圍內進行準確定量。使用時只需加入模板、引物和水,便可在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線,對目的基因進行準確定量檢測,重復性好,可信度高。

    注意事項

    1. 本制品中不含內參染料ROX,ROX染料單獨供應??突Р⒏輖PCR儀器技術指導決定是否需要加ROX內參染料,用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差。

    儀器型號

    ROX Solution I

    50μl反應體系加入量

    ROX Solution II

    50μl反應體系加入量

    ABI:5700,7000,7300,7900HT,StepOneTM,StepOnePlusTM,ABI PRISM7000 and 7700

    1 μl

    -

    ABI 7500/7500 Fast;ABI ViiA7; ABI Q5 Q6; ABI Quant Studio 6/7 Flex; Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P及其他儀器

    -

    1 μl

    Bio-Rad: iCycler® iQ, iQ5 and MyiQ™, Opticon®, CFX 96, CFX 384

    Roche: LightCycler® 480, LightCycler® 2.0

    Eppendorf: MasterCycler™ ep realplex

    Corbett: Rotor-Gene™ 3000, 6000

    Cepheid: Smart Cycler®

    杭州博日

    不需要

    不需要

    2. 本制品含SYBR® Green I,強光下易分解,使用時避免長時間強光照射本制品。

    3. 建議在冰上配制qPCR反應液,再放入qPCR儀器中擴增??梢蘊岣呃┰鎏匾煨?,減少背景。

    4.-20℃下保存時間較長,有微量沉淀產生,充分混勻后不影響使用。本制品已經優化了反應緩沖液中的Mg2+濃度,無需再調節Mg2+濃度。

    5. 模板DNA:用本產品,cDNA、基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時請注意模板量對PCR擴增的影響。本產品建議添加量為:cDNA添加量不應超過總反應體系的10%;基因組DNA為模板時,為避免在高濃度區域出現線性差的情況,請注意添加量小于500ng;病毒DNA也可作為PCR模板,添加時請以300ng為上限;由于質粒DNA濃度和拷貝數很高,在添加PCR模板之前最好進行稀釋梯度試驗,以便確定合適的質粒DNA拷貝數。

    6. 引物:

    建議每條引物工作濃度200 nM ~ 800 nM;為得到高靈敏度定量性的數據,引物的設計非常重要。以下列舉了設計引物時需注意的一般事項。

    a) 引物長度請設定為18bp30bp、GC含量為40%65%;

    b) 擴增片段一般小于300bp,如可能請盡量設定在80bp150bp。過長的片段容易導致擴增效率降低;

    c) 如設計mRNA為目的片段的引物,設計應盡量橫跨內含子,以防止基因組DNA的擴增而引起假陽性;

    d) 請盡量選擇Tm65℃~67℃;

    e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC richAT rich(特別是3'端)。避開T/CPolypyrimidine)或A/GPolypurine)的連續結構;

    f) 避開引物內部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。二條引物間的3'末端避開有2個堿基以上的互補序列;

    g) 引物設計完成后要使用BLAST檢索確認引物的特異性。

    此外,引物的純化純度對反應特異性有很大的影響。經過一般純化、純度較低的引物熒光強度散亂,容易產生非特異性產物,致使熔解曲線出現雜峰。請盡可能使用HPLC級別純化,至少要用經Cartridge(OPC)級別以上純化的引物。

    7. 對照設計:

    1No template controlNTC):qPCR反應體系中僅僅缺少模板。用以檢測有無二聚體和試劑有無污染。

    2Reverse Transcripase control用以評估逆轉錄反應中有無基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。

    ●     使用說明:

    1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix,徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。

    2. 按照下表在0.2 ml PCR管中制備反應體系:

     

    50μl反應體系

    20μl反應體系

    終濃度

    2×qPCR MasterMix

    25 μl

    10 μl

    上游引物 10 μM

    1 μl

    0.4 μl

    0.2 μM

    下游引物 10 μM

    1 μl

    0.4 μl

    0.2 μM

    ROX Slolution I or II(50×)

    1 μl or 不加

    0.4 μl or 不加

    x

    模板

    × μl

    x μl

    10pg-100ng

    補至50 μl

    補至20 μl

     

    3. 快甩離心將反應液收集到管底。

    4. 檢測片段大于300bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(三步法):

    步驟

    溫度

    時間

    循環數

    初始變性

    95

    1 min*

    1

    變性

    95

    15 sec

    40

    退火

    55

    30 sec

    延伸

    72

    30sec

    檢測片段小于300bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(兩步法):

    步驟

    溫度

    時間

    循環數

    初始變性

    95

    1 min*

    1

    變性

    95

    15 sec

    40

    退火和延伸

    60

    60 sec

    注:由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經過抗體修飾的,初始變性951 min即可。

    實驗結果分析

    反應結束后加做融解曲線,以區分擴增產物及引物二聚體。根據擴增曲線和融解解曲線結果可進行PCR定量標準曲線的制作。

    常見問題及處理

    問題

    可能原因

    推薦的解決方法

    無擴增曲線且無擴增產物(凝膠電泳)

    反應體系中有PCR反應抑制劑

    更換或純化模板DNA。

    引物設計不合理

    重新設計、合成引物。

    逆轉錄產物體積過量

    減少逆轉錄產物量以不超過反應體系的10%。

    加樣錯誤或有試劑未加

    檢查是否加了所有的所需試劑。

    引物的降解

    通過PAGE電泳檢測引物完整性。

    退火溫度不正確

    優化退火溫度。

    無擴增曲線但有擴增產物(凝膠電泳)

    qPCR儀設置不正確

    檢查dye selction,reference dye是否選擇正確

    失效的熒光檢測

    熒光檢測應在PCR循環的退火/延伸階段。

    熒光PCR儀問題

    參考qPCR儀器說明書

    陰性對照(NTC)有擴增曲線

     

    反應體系中有污染

    qPCR片段較小,極易造成環境中氣溶膠污染。如果融解曲線分析,解鏈溫度和目的片段相同,凝膠電泳中NTC中的片段大小和目的片段相同,極有可能是反應體系中某一或某些試劑污染所引起的。建議換至沒有污染源的環境進行PCR體系的配制。

    引物二聚體

    進行溶解曲線分析,如果擴增曲線的解鏈溫度小于80,凝膠電泳片段大小和目的片度不符。請重新設計引物。

    提高退火溫度3。

    PCR效率高于110%

    (斜率>-3.1

    有非特異性擴增

    溶解曲線分析非特異性擴增;優化引物設計

    PCR擴增效率低于90%

    (斜率<-3.6)

    反應體系中有PCR反應抑制劑

    更換或純化模板DNA

    PCR擴增條件不合適引起擴增效率降低。

    確認引物濃度。

    注意qPCR Master Mix是否失效。

    引物設計

    重新設計引物,避免擴增區域的DNA二級結構。

    實時熒光曲線線性不好

    模板DNA含量較低或過高

    應調整樣品的DNA濃度。

    模板DNA中含有抑制PCR擴增反應的物質

    對模板DNA進行純化或更換模板。

    質量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA,逆轉錄反應液中所含的物質可能抑制PCR反應。

    請降低樣品濃度,或將樣品純化后再進行反應。建議使用品牌質量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。

    CT值高于預期值

    加入的模板量太少

    適當增加模板量。

    樣品被降解

    檢查樣品的完整性。

    引物不合適

    重新設計合成引物。

    CT值低于預期值

    加入了過多的模板

    減少模板量。

    PCR產物太長

    一般采用100-150bp的產物長度,一般不超過500bp

    CT值的標準差>0.16

    取樣不準確

    每種樣品的反應混合液單獨配制,充分混勻;

    qPCR之前要離心,管壁不要沾有反應液。

    ΔRn值太小

    PCR效率太低

    優化PCR反應條件。

    目標模板數太低

    增加模板量。

    擴增曲線的熒光信號弱,或擴增曲線呈鋸齒狀

     

    ROX添加量太大

    使請根據ROX使用方法和使用的PCR儀進行確定ROX的添加量。

    熒光校正錯誤

    請聯系PCR儀器工程師或參照PCR儀器的使用說明書,進行本底和熒光校正。

    PCR的延伸時間過短即熒光讀取時間不充分,熒光收集不能充分完成。

    適當增加延伸時間。

    以少于PCR儀器標準條件的反應體積進行擴增,熒光收集量的誤差會增大

    應增加反應體積以滿足PCR儀器標準。

     



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