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·PCR
 
 
 





RTScript All-in-One 1st-Strand cDNA Synthesis Kit
 產品貨號: RTR2103
 產品名稱: RTScript All-in-One 1st-Strand cDNA Synthesis Kit
 產品價格/規格: 50次 800元
 產品說明書: 暫無
 更新時間: 2019-07-12
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  • RTScript All-in-One 1st-Strand cDNA Synthesis Kit

    ●    產品貨號及規格:

    貨號

    包裝

    貯存

    RTR2103-01

    50×20μl

    -20

    ●    產品簡介:

    本試劑盒含有反轉錄需要的全部試劑(RTScript MMLv Reverse Transcriptase,RNase Inhibitor,dNTP、反應 Buffer,Oligo (dT)18,Random primer),濃度為2×。進行RNA反轉錄反應時,只需加入模板和RNase Free H2O 即可高效合成第一鏈cDNA,大大簡化了操作過程、提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。本制品含有去基因組成分gDNA Remover,以RNA為模板進行cDNA第一鏈合成時,可以同步去除基因組DNA污染,反應結束后,75℃加熱5分鐘,就可以失活反轉錄酶,RNA酶抑制劑。具有快速簡便、重復性高、特異性好、靈敏度高和穩定性好的特點。該試劑盒采用的反轉錄酶去除了 RNase H活性,從而避免反轉錄過程中降解RNA。 同時經過突變文庫篩選,使得其熱穩定性更強,可耐受50℃高溫反應。相比于低溫條件下反轉錄反應,采用高溫反轉錄可顯著打開 RNA二級結構,從而提高復雜 RNA 模板的擴增性能、提高反轉錄 cDNA的長度和產量,從而提高后續檢測的靈敏度。合成的第一鏈 cDNA可廣泛用于 2nd Strand 的合成、 雜交、 PCR擴增、Real-Time PCR 反應等。

    ●    貯存:

     -20℃貯存兩年。

    ●    試劑盒組成:

    名稱

    數量

    2×RTScript 1stStrandcDNA Synthesis MasterMix

    500 μl

    RNase-free H2O

    1 ml

    gDNA Remover

    50 μl

    ●    使用方法:

    . 第一鏈cDNA合成:

    1:去除gDNA污染:

    組份

    加入體積

    Total RNA/mRNA

    100ng-2μg(9 μl)

    gDNA Remover

    1μl

    RNase-free H2O

    up to 10 μl

    42處理 10min,冰上放置。

    2. 反轉錄反應:

    組份

    加入體積

    步驟1中的反應液

    10 μl

    2×RTScript 1stStrandcDNA Synthesis MasterMix

    10μl

    輕輕混勻,離心。

    若 cDNA后續用于 qPCR,逆轉錄時間:50℃孵育15min,

    若 cDNA后續用于普通 PCR,逆轉錄時間:50℃孵育30min。

    3. 終止反應:

    75℃孵育 5min,終止反應。 反應產物可直接用于 PCR,如果不立即使用,-20°C保存,長時間保存建議-70°C放置。

    . 第二鏈cDNA合成:

    合成的第一鏈cDNA可直接用于PCR。 常用反應體系(50 μl):

    按照下表在0.2ml PCR管中制備反應體系:

     

    50μl反應體系

    終濃度

    2×Taq PCR MasterMix

    25μl

    上游引物 10μM

    1-5μl

    0.2-0.8 μM

    下游引物 10μM

    1-5μl

    0.2-0.8 μM

    模板

    × μl

    10pg-1μg

    補至50μl

     

    PCR儀上執行以下程序:

    步驟

    溫度

    時間

    循環數

    初始變性

    94℃

    5 min

    1

    變性

    94℃

    30 sec

    25-40*

    退火

    Tm-5℃*

    30 sec

    延伸

    72℃

    1 min/kb

    最后延伸

    72℃

    5 min

    1

    *注: PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況,設定最佳的反應條件(溫度、時間等)。


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