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植物Rubisco活性測定試劑盒
 產品貨號: PU1060
 產品名稱: 植物Rubisco活性測定試劑盒
 產品價格/規格: 80-100次 6000元
 產品說明書: 暫無
 更新時間: 2019-08-08
詳細信息   訪問次數:次

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    植物Rubisco測定試劑盒

    產品組成:Plant Rubisco Assay Kit

    組分貨號

    名稱

    規格

    貯存

    運輸

    PU1060-01

    試劑1-Rubisco提取緩沖液(2×)

    100 ml

    4

    常溫

    PU1060-02

    試劑2-10×Assay buffer

    15 ml

    -20℃

    常溫

    PU1060-03

    試劑3-GAPDH200×)

    1 KU/1ml

    -20℃

    常溫

    PU1060-04

    試劑4-PGK100×)

    500 U/1ml

    4℃

    常溫

    PU1060-05

    試劑5-CPK100×)

    1 KU/1ml

    -20℃

    常溫

    PU1060-06

    試劑6-ATP100×)

    1.2 ml

    -20

    常溫

    PU1060-07

    試劑7-CrP100×)

    1.2 ml

    -20

    常溫

    PU1060-08

    試劑8-NADH100×)

    1.2 ml

    -20

    常溫

    PU1060-09

    試劑9-RuBP

    1.4 ml×2

    -20℃

    常溫

    PU1060-10

    試劑10-酶溶解緩沖液

    5 ml

    -20℃

    常溫

    DE005

    試劑11-滅菌水

    100 ml

    4℃

    常溫

    BSA-02

    試劑12-BSA溶液 50mg/ml

    5 ml

    -20

    常溫

    DT0140P

    試劑13-1MDTT100×)

    1 ml×2

    -20

    常溫

    PC2030-01

    蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×)

    1 ml

    -20

    常溫

    ●     產品簡介:

    核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調節酶,是植物中最豐富的蛋白質,主要存在于葉綠體的可溶部分,總量約占葉綠體可溶蛋白50%~60%。

    這里1分子CO2被固定,就有2分子 NADH 被氧化。因此,由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性,由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。

    為了使NADH的氧化與CO2的固定同步,需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統。

     按照1 ml 反應體系計算,該試劑盒可以測定80-100個樣品。

    自備材料:

    植物材料;剪刀;液氮;研缽或其他研磨設備;1.5ml離心管;1ml石英比色皿;紫外分光光度計;制冰機;低溫離心機

    操作步驟:

    一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制:

     

    一個反應配制體積

    n個反應配制體積

     

    1 ml

    n×1 ml

    Rubisco提取緩沖液(

    0.5 ml

    n×0.5 ml

    滅菌水

    470 μl

    n×470 μl

    1 M DTT100×

    10 μl

    n×10 μl

    BSA溶液50mg/ml

    20 μl

    n×20μl

    蛋白酶抑制劑(100×

    10 μl

    n×10μl

    注:1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現配現用,短期4中可以過夜保存。

    2. 為增強Rubisco的穩定性,提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑(CatPC2030

    、 Rubisco樣品提?。?/b>

    1. 取新鮮植物組織,清洗干凈,擦干,液氮中研磨,1 cm2葉片(1分硬幣大?。┗?.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液,顛倒混勻,冰浴放置5-10分鐘。

    2.12000g4離心 10分鐘,上清即為Rubisco樣品提取液,常溫放置備用(不要冰浴或4℃放置,常溫放置可以保持Rubisco活性)。

    注:Rubisco樣品提取液最好立即測定,不建議保存。

    、 Rubisco活性測定分析

       1. 即用型酶溶解緩沖液配制:

          按照標簽所示,在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液,冰浴備用,-20℃保存。

    2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液,混勻溶解后冰浴備用,-20℃保存。

       3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液,4℃12000g離心5分鐘,去除上清(小心去除,可以保留少許上清,不要吸棄沉淀),沉淀中按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液,混勻溶解后冰浴備用,-20℃保存。

    4. 試劑9-RuBP:按照標簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

    注:RuBP溶液穩定性較差,用后-20℃保存,有效期3-4天,長期-80℃保存。

    5. 試劑8-NADH:按照標簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

    注:NADH穩定性較差,用后-20℃貯存3-4天,長期-80℃保存。

    6. 反應體系MasterMix配制:

    加入順序

    組份

    1ml反應體系加入量

    MasterMix配制

    (測定n個樣品為例)

    1

    10×Assay Buffer

    100 μl

    n×100μl

    2

    滅菌水

    795μl

    n×795μl

    3

    ATP溶液(100×

    10 μl

    n×10μl

    4

    CrP溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    5

    GAPDH溶液(200×

    5 μl

    n×5 μl

    6

    PGK溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    7

    CPK溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    8

    NADH溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    7. 反應體系測定;

    1.5 ml離心管中配制以下反應。

     

    1

    2

    3

     

    對照反應

    初始活性測定

    總活性測定

    MasterMix

    950 μl

    950 μl

    950 μl

    即用型Rubisco提取緩沖液

    (步驟一)

    25 μl

    -

    -

    Rubisco樣品提取液

    (步驟二)

    -

    25μl

    25μl

    常溫放置15分鐘

    試劑9-RuBP溶液

    25 μl

    25 μl

    25μl

     

     

    加入RuBP后立即測定OD340讀數,記錄60秒內OD340值變化。

    注:一般分光光度計OD340讀數在0.5-3之間數據比較準確,低于此范圍說明提取用的材料太少,Rubisco活性太低;高于此范圍說明所用材料太多,Rubisco活性太高,此時可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測定。

    、Rubisco活性計算:

    根據如下公式計算樣品中Rubisco活初始性和總活性:

    Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化

    △A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值

    N-稀釋倍數,本程序中為40(1 ml提取液,取25μl測定)。

    6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數

    d-cm 比色皿光程,一般為1

    t-秒 測定時間,本程序為60秒

    S-cm2 提取時使用的葉面積



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