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2×DNA連接緩沖液 2×ligation solution MasterMix
 產品貨號: RTV701
 產品名稱: 2×DNA連接緩沖液 2×ligation solution MasterMix
 產品價格/規格: 150ul 150元
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 更新時間: 2019-10-18
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  • 2×ligation solution MasterMix

    2×DNA連接緩沖液

     

      產品組成:

    貨號

    名稱

    規格

    RTV701

    2×ligation solution MasterMix

    150 μl

    注;按照10μl連接體系計算,每次使用5μl,可以使用30次。

    保存:-20

    產品簡介:

    2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase,ligation buffer2×MasterMix,實驗時,只需加入片段和載體即可進行連接反應。

    適用于DNA片段和載體DNA的連接以及DNA片段和LinkerAdaptor DNA的連接。

    注意事項

    12×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase,使用前冰浴中徹底融化,混勻后使用。

    2.為了提高轉化效率,轉化時建議所加入連接產物的量不要超過感受態細胞體積的10%。

    使用方法:

    DNA片段和載體DNA的連接

    1粘性末端的連接

    1.反應體系:

     

    10μl體系

    終濃度

    線性載體DNA

    x μl

    10-50 ng

    插入DNA片段

    y μl

    插入片段:載體=1:1-5:1*

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    *:載體與插入片段的摩爾數比需要優化:一般vector:insert1:1~1:5之間均可得到較好的結果。用以下公式計算片段摩爾數:pmol= DNA(ng)/(660×片段bp)×1000。例如:插入片段2000bp,線性載體為3000bp,如果載體使用量為50ng0.025pmol),10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3,則需要2000bp pmol數為0.075pmol,插入片段2000bp的使用量為100ng。

    2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

    3.反應條件:16孵育30分鐘。

    4.可取5 μl連接產物熱擊轉化50 μl感受態細胞或取1-2 μl連接產物電擊轉化50 μl感受態細胞。

    注:1)若要提高電轉實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后進行電擊轉化。

    2)若要提高轉化子數目,可將連接時間延長至1小時。

    2平末端的連接

    1.反應體系:

     

    10μl體系

    終濃度

    線性平末端載體DNA*

    x μl

    10-50 ng

    插入DNA片段

    y μl

    插入片段:載體=1:1-5:1**

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    *:平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時,應首先將載體進行去磷酸化處理,以防止其自身環化。

    **:載體與插入片段的摩爾數比需要優化:一般vector:insert1:1~1:5之間均可得到較好的結果。用以下公式計算片段摩爾數:pmol= DNA(ng)/(660×片段bp)×1000。例如:插入片段2000bp,線性載體為3000bp,如果載體使用量為50ng0.025pmol),10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3,則需要2000bp pmol數為0.075pmol,插入片段2000bp的使用量為100ng。

    2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

    3.反應條件:16孵育30分鐘。

    4.可取5 μl連接產物熱擊轉化50 μl感受態細胞或取1-2 μl連接產物電擊轉化50 μl感受態細胞。

    注:1)若要提高電轉實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉化。

    2)若要提高轉化子數目,可將連接時間延長至1小時。

    線性DNA的自身環化

    1.反應體系:

     

    10μl體系

    終濃度

    線性載體DNA

    x μl

    10-50 ng

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

    3.反應條件:16孵育30分鐘。

    4.可取5 μl連接產物熱擊轉化50 μl感受態細胞或取1-2 μl連接產物電擊轉化50 μl感受態細胞。

    注:1)若要提高電轉實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉化。

    接頭連接


    1.反應體系:

     

    10μl體系

    終濃度

    線性DNA

    x μl

    100-300 ng

    磷酸化接頭

    y μl

    0.5-1 μg

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

    3.反應條件:16℃孵育30分鐘。

    4.65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase。連接產物可以直接進行限制性內切酶酶切反應。



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